1.4.3 Nisin的遗传方面
目前,已经确定了Nisin的前体分子,其结构基因也已被分离和表征,编码Nisin的引物是一段可传送基因组(块)(gene block),它也能对Nisin耐受性和蔗糖代谢进行编码。此基因组位于染色体中而不是在基粒中,L.lactis合成Nisin的能力因而被表现出来。
1.4.4 Nisin的作用模式
Nisin的抗菌作用呈浓度依赖型,即和Nisin自身浓度、敏感菌细胞或芽孢浓度相关。Nisin具有抑菌(bacteriosatic)或杀菌作用,这要依赖于目标微生物的生理状态和情况。出于能量状态的营养繁殖细胞较处于静止状态的营养繁殖细胞更易被杀死,杀菌作用最常发生在目标微生物处于最适pH、温度和水活度(aw)的情况下。相反,食品系统菌的抑制是在多重保护系统中获得最好的效果,这种多层保护系统称之为障碍技术(hurdletechnology),它发生在菌的非最适pH、温度和水活度(aw)的情况下。
Nisin对敏感革兰氏阳性营养繁殖细胞的作用缘于破坏细胞质膜。早期研究表明Nisin作用于营养繁殖细胞后,细胞内物质迅速漏出,包括ATP和其他离子,伴随着膜电势的完全丧失。如果细胞质膜受到的作用较严重,可能发生细胞的完全溶解,大多数革兰氏阴性菌对Nisin呈耐受性,但能增加细胞壁穿透性的任何处理或试剂应用均会大大改善它们对Nisin的敏感性。
Nisin对芽孢菌的作用模式是不同的,研究表明芽孢对Nisin远较产生芽胞的营养繁殖细胞敏感。对大多数菌是抑制芽胞作用,此作用在芽孢变模糊后,膨胀和生长前开始。这种作用在热加工食品(如加工干酪)的保藏中是重要的,这是因为有效量的Nisin可在整个食品贮存期内保存,另外,芽孢的进一步热处理导致其对Nisin敏感性的增加。
Nisin对敏感营养繁殖细胞和革兰氏阳性菌芽孢的最小抑制浓度明显不同,即使在相同菌的不同品种系也有不同。革兰氏阳性敏感菌包括以下列菌:片球菌、乳杆菌、乳球菌、明串珠菌和芽孢杆菌等。能被Nisin有效抑制的梭菌(Clostridium)包括生孢梭菌(C.sporogenes)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)和丁酸梭菌(C.butyricum),它们和加工干酪的腐败密切相关。由于Nisin主要用于营养繁殖细胞已被热处理杀死的食品,耐热菌嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、热解糖梭菌(C.thermosaccharolyicum)的芽孢对Nisin呈高敏感性,0.025mg/ml的Nisin对它们表现出抑制作用,而Nisin对蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌抑制的有效范围分别为1.875~2.5mg/ml、0.652~2.5mg/ml、1.25~2.5mg/ml。
Nisin对肉毒梭菌(C.botulinum)芽孢的敏感性应给予特别注意,美国的研究表明在培养基中Nisin能有效防止C.botulinum的ABC型芽孢生长。Nisin对C.botulinum芽孢抑制的有效性随下列因素的变化而增加:降低pH、增加热击昏的时间和温度、减少芽孢负载。
1.4.5 Nisin的溶解性和稳定性
Nisin在酸性底物中较易溶解,pH上升溶解性下降,当pH为2时溶解浓度约为56mg/ml,pH为5时是3mg/ml,pH为7时仅为1mg/ml。因为在食品保藏中Nisin的应用水平很少高于0.025mg/ml,故溶解性不是其应用于食品中的障碍。商业制备物含有来自发酵的不溶性残留固体,它会产生絮状悬浮物,但它们对Nisin的效率没有不良影响。
商业制备物在2年的贮存期内没有活性损失,它一般保存于干燥、黑暗、低于25℃的地方。Nisin分子在性质上呈酸性,随着pH增加,热处理稳定性下降:PH=2时的Nisin溶液在115℃、121℃灭菌时呈稳定性;PH=5时损失活性的45%;pH=7时活性损失90%以上。杀菌对Nisin的活性基本无影响,大蛋白质的存在有助于改善食品中Nisin对热的稳定性。
在食品贮存过程中也发生Nisin活性损失的情况,损失的程度依赖于贮存的pH和温度,当贮存温度为25℃时Nisin活性为60%(与低于25℃的贮存温度相比),30℃时活性仅有40%。如果在pH5.6~5.8的杀菌加工干酪中,85~105℃热处理5~10min,Nisin活性损失80%。因为Nisin对芽孢的作用主要是抑制芽孢而不是杀死芽孢。故在食品中必须有足够量的残留Nisin,以在整个贮存期内对任何残留菌芽孢的抑制保持活性。食品贮存的温度愈高,则在食品中添加的Nisin量愈高。
1.4.6 影响Nisin活性的因素
食品中的许多因素可抵消或部分抵消Nisin的作用,在未经加热或较轻微波热加工食品中,来自微生物、植物或动物的蛋白酶在食品贮存过程中会分解Nisin,使其失活。由于Nisin呈疏水性,食品中的脂肪类物质会干扰其在食品中的均匀分布,使其无法发挥抑菌作用。许多食品添加剂对Nisin也有抵消作用,Nisin在硫代硫酸钠和TiO2存在的情况下将被分解。