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γ-干扰素的研究进展及在畜牧中的应用

1.3 IFN-γ受体  IFN-γ受体发球细胞因子受体超家族(cytokine receptor superfamily)的一员,与其他受体不同的是它自己本身没有激酶活性。研究结果表明,IFN-γ受体由2条种属特异性的多肽链组成,IFNGR-1(A链)和IFNGR-2(B链),A链和B链都包括胞外区、跨膜区和胞内区3个部分,其中胞外区负责与IFN-γ结合,具有种属特异性;与受体胞外区相连的是一个跨膜区,负责信号向胞内传递;胞内区也有一些蛋白酶与之相连。其中IFN-γ受体(IFN-γR)由α和β2种亚基组成。IFN-γR的α、β亚基分别定位于人第6和21对染色体上,以及小鼠第10和16对染色彩带上。α亚基即配体结合亚基,是二价的高亲和力受体,与同型二聚体的IFN-γ结合形成稳定的1:2中间复合体,其胞外区与IFN-γ的N末端结合,而胞液区与C末端结合。随后,这一中间复合体作为结合模板,结合2分子β亚基,生成有活性的1:2:2信号复合体,从而介导信号向细胞内传递。IFN-γ与细胞表面特异性受体结合后可触发受体蛋白的磷酸化和二聚体化,激活宿主效应基因,抑制病毒复制,通过广泛表达的特异性受体(除红细胞上不表达)发挥作用。如人IFN-γ受体由2条链组成:IFNGR-1及IFNGR-2。IFNGR-1分子质量为90 ku,为结合配体所必需,其基因定位于人染色体6q16-22或鼠16号染色体;IFNGR-2,主要参与信号传导,其基因定位于人染色体21q22.11或鼠16号染色体(孙曼妮,2007)。其他动物的IFN-γ受体未见报道。
2  IFN-γ的基因表达与调控
基因工程技术的发展,极大促进了IFN-γ的研究和发展,使IFN-γ基因的克隆与表达成为可能,通过克隆表达IFN-γ基因获得多肽将带来极大的社会经济效益。Goeddel(1998)报道IFN-γ基因克隆成功。1995年,人IFN-γ基因被准确定位于12号染色体1区4带(12q14),有4个外显子,转录因子指导IFN-γ基因的表达。此外还发现,IFN-γ基因有3个内含子,定位于小鼠第10对染色体上。随后在畜牧中畜禽的IFN-γ相继地被克隆和表达,并且不同种类的IFN-γ基因表达也不一样,表明了IFN-γ基因表达具有种类特异性。
Digby等(1995)首次成功克隆了鸡Ⅱ型干扰素(chicken interferon-γ)基因,它含有492bp的开放阅读框架,编码164个氨基酸,成熟蛋白由145个氨基酸组成,分子质量为16.8ku,与马和人的氨基酸序列同源性分别为35%和32%,而与Ⅰ型IFN的同源性仅为15%。因此,根据核苷酸和氨基酸序列的变异规律,可以推算IFN基因的进化过程。据估计每1百万年单拷贝DNA的变异率为0.1%,故推断,IFN-Ⅰ、Ⅱ的出现发生在3.5亿年以前的鸡和哺乳动物的分化。与国外研究比较,国内对鸡IFN-γ的研究起步较晚。刘胜旺等(2000)运用RT-PCR技术在ConA刺激的鸡淋巴细胞中克隆到该基因,在此基础上,丁忠庆等将该基因亚克隆与大肠杆菌原核表达载体上,并获得高效表达。曹瑞兵等(2004)从经ConA诱导培养的猪外周血白细胞中扩增出猪IFN-γ基因,经改选后插入原核表达载体pRLC,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在,经变性、复性、脱盐、凝胶层析纯化处理,重组猪IFN-γ具有较高的干扰素活性。王云龙等(2007)研究结果表明,根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,成功地合成了poIFN-γ的成熟蛋白编码基因,转入表达载体pBV222中,实现了poIFN-γ在大肠杆菌中的高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。谢昆等(2007)在原核和真核表达系统中成功的表达了重组鹅IFN-γ成熟蛋白,并制备出了其原核表达产物的多克隆抗体。张红燕等(2004)构建转化载体pPIC9K/bovIFN-γ基因,并转化至巴斯德毕赤酵母GSII5中,获得重组酵母菌GSII5/bovIFN-γ。潘志明等(2005)采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从奶牛脾脏淋巴细胞中扩增出了bovIFN-γ成熟肽段cDNA,并在大肠杆菌中成功表达了有活性的配合蛋白。